微量凱氏定氮法

 (Mirco Kjeldahl determine)

一、目的

   1、學習微量凱氏定氮法的原理

   2、掌握微量凱氏定氮法的操作技術，包括標準硫酸銨含量的測定，未知樣品的消化、蒸餾、滴定及其含氮量的計算等。

二、原理

   凱氏定氮法常用于測定天然有機物(如蛋白質，核酸及氮基酸等)的含氮量。

   天然的含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨，并進-步與硫酸作用生成硫酸銨。此時程稱之為“消化”。

    但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應的沸點，并加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。甘氨酸的消化過程可表示如下:

    濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氮，借水蒸汽將產生的氨蒸餾到一定量，一定濃度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨與溶液中的氫離子結合，生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止,后根據所用標準酸的當量數(相當于待測物中氨的當量數)計算出待測物中的氮量。

    滴定時用甲烯藍和甲基紅混合指示劑，其指示范圍為pH5.2~5.6,NH4H2BO3的藍色滴至原來H3BO3的藍紫色即為終點。

    本法適用范圍0.2-1.0毫克氮。相對誤差應小于2%。

三、材料、試劑與器具

(一)材料

人的血清或豬的血清

(二)試劑

1、 濃硫酸(化學純)

2、30%氫氧化鈉(分析純)溶液

3、0.9%NaC1 溶液

4、硫酸鉀一硫酸銅混合物:硫酸鉀與硫酸銅(CuSO4、 5H2O)以3: 1 (W/W)的配比混合研磨成粉末。

5、2%硼酸

6、混合指示劑的配制:

    方法一:取50毫升0.1%甲烯藍無水醇溶液與200毫升0.1%甲基紅無水乙醇溶液混合配成，貯于棕色瓶備用，這種指示劑酸性時為紫色，堿性時為綠色，變色范圍窄且靈敏。

    方法二: 0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10毫升與0.1%甲基紅乙醇溶液2毫升混和即成。

    本指示劑的變色范圍為pH5.2→5.4→>5.6

                         紫紅色 灰色 綠色

 7.0.0100M HC1

 8.硼酸一指示劑混合液:取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示劑貯備液，搖勻后溶液呈現紫紅色即可。(約加1毫升左右混合指示劑)

 9.標準硫酸銨溶液(0.3 毫克氮/毫升)

(三)器具

1、凱氏燒瓶

2、消化架

3、吸量管(1毫升、2毫升)

4、量筒(10毫升)

5、凱氏定氮蒸餾裝置

6、微量滴定管(3毫升、5毫升，可讀至0.02毫升)

7、錐形瓶(50-100毫升)

8、容量瓶(50 毫升)

四、操作步驟

(一)樣品的處理

    血清樣品:取人血(或豬血)，放于離心管中，于冰箱中放置過液，次8離心除去凝xue塊，上層黃色透明清液即為血清。準確吸取血清1.0毫升加入0.9%NaCl4.0毫升,仔細混勻備用。

   固體樣品:某一固體樣品中的含氮量是100克該物質(千重中所含氮的克數)來表示(%)。因此在定氮前，應將固體樣品中的水份除掉。一般樣品干燥的溫度都采用105°C，因為非游離的水都不能在100°C以下烘干。

   在稱量瓶中稱入一定量的磨碎的樣品，然后置105°C的烘箱內干燥4小時。用坩堝將稱量瓶放入干燥器內，待降至室溫后稱重，按上述操作繼續烘干樣品。每干燥1小時后，稱量--次，直到兩次稱量的數量不變，即達恒重。

 (二)消化

   取2個50毫升的凱氏燒瓶，向號燒瓶內加2毫升稀釋血清溶液(或4毫升核酸制品溶液，或200毫克固體粉末)。注意，用吸量管直接將溶液(或用試管加入固體樣品)加至燒瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶頸上，向2號燒瓶加入2毫升水作空白對照。

   在每個燒瓶內加入硫酸鉀一硫酸銅混合物約0.2克，濃硫酸3毫升，小瓷片兩粒,搖勻。將燒瓶約60度角固定在鐵架上,每個瓶口放一小漏斗，在通風廚內的電爐上消化。

   在消化開始時，應控制火力，不要使液體沖到瓶頸。待瓶內水汽蒸完，硫酸開始分解并放出SO2白煙后，適當加強火力，繼續消化，直至消化液呈透明綠色為止。消化完畢，待燒瓶內容物冷卻后，加蒸餾水10 毫升(注意慢加，邊加邊搖)。冷卻后將瓶內容物轉入50毫升的容量瓶中，并用蒸餾水洗燒瓶數次，溶液一并倒入容量瓶，后定容至刻度搖勻，做上記號備用。

(三)蒸餾

1、儀器的洗滌:儀器應先經一般洗滌，再經水蒸氣洗滌。

蒸餾器(圖1-1)有幾種，應用前需熟悉其使用方法。使用方法如下:

    開放自來水，使水E進入G，從K管流出(水不宜開得過大以免水從G管溢出)。開放P3，使水進入A室，漏斗D中加蒸餾水約10毫升入B室。用拇指將管口按緊，同時開放P1，則B室中的水先從Y型管口沖出，隨后A室中水經K管流出，一般情況下如此重復洗滌兩次即可。若蒸餾器內有氨存在，則應加入蒸餾水后，不加樣品蒸餾一次方可使用。(可用PH試紙檢查。)

    A為蒸氣發生室，P3為其開關，P1為出水開關，B為蒸餾室，與出氣室M相遇，M管插入盛有定量酸液的錐形瓶，B室內有Y型管，一端與A室相通，另一端經P4與漏斗D相連，可經此將樣品及試劑加入B室，F為指形冷凝管，E為進水管，水經F、G、K而流出，蒸餾時B室進消化好的樣品及NaOH,二者反應產生氨，B室經M管進入錐形瓶中的酸吸收。

 2、滴定標準樣品

    先用標準硫酸銨溶液試驗2-3 次。蒸餾器洗凈后，開放水P3，使水進入A室，水放至A室球部即可。

    取3個50毫升的錐形瓶，各準確加入10毫升硼酸(內加有混合指示劑)。用表面皿復蓋備用。

    加樣:用吸量管吸取1毫升標準硫酸銨溶液，細心地由漏斗D傾入蒸餾室，再用蒸餾水1毫升清洗漏斗。取一個盛有硼酸一混合指示劑的錐形瓶，置于M管下，使管口恰好接觸硼酸溶液，用量筒從漏斗D加入30%氫氧化鈉8毫升，隨即將P4夾緊，并往漏斗加入少量蒸餾水封閉。

    蒸餾:用酒精燈加熱(應用擋風板將燈圍攏，維持火力恒定，沸騰不可高于Y管口以免A室溶液從Y管倒吸，待滴蒸餾液從冷凝柱F頂端滴下時起，繼續蒸餾5分鐘，然后將錐形瓶放低，使導管離開液面再蒸2分鐘,后用蒸餾水洗導管外壁，蒸餾完畢，取下錐形瓶，隨即將蒸餾器洗凈。)

 3、樣品及空白蒸餾:用吸量管分別吸取1毫升樣品和1毫升蒸餾水按上述操作步驟進行蒸餾。

 4、滴定:蒸餾完畢，用0.0100N標準鹽酸溶液滴定錐瓶內溶液至淡紫色或灰色，記錄所用鹽酸的量。

(四)計算

   式中: A為漓定樣品用去的鹽酸平均毫升數； B為滴定空白用去的鹽酸平均毫升數； C為稱量樣品的克數:0.0100為鹽酸的當量濃度(實際上，此項應按實驗中使用鹽酸的實際濃度填寫)； 14 為氮的原子量；6.25為常數(1毫升0.1N鹽酸相當于0.14毫克氮)。
    若樣品中除有蛋白外，尚有其他含氮物質，則樣品蛋白質含量的測定要更復雜一些。首先需向樣品中加入三lv乙酸，使其終濃度為5%，然后測定未加三lv乙酸的樣品及加入三lv乙酸后的樣品的上清液中的含氮量，從而計算出蛋白氨，再進一步算出；蛋白質的含量。
           蛋白氨=總氮-非蛋白氨
           蛋白質含量(克%) =蛋白氮X6.25

五、注意事項

   1、凱氏法的優點是適用范圍廣，可用于動植物的各種組織，器官及食品等成組復雜樣品的測定，只要細心操作都能得到的結果。其缺點是操作比較復雜，含有大量堿性氨基酸的蛋白質測定結果偏高。

   2、普通實驗室中的空氣中常含有少量的氨，會影響結果，所以操作應在單獨潔凈的房間中進行，并盡可能快地對硼酸吸收液進行滴定。

六、實驗報告

繪畫蒸餾裝置圖，計算待測樣品的總氮量和蛋白質含量

七、思考題

1、正式測定未知樣品前為什么必須測定標準硫酸銨的含氮量及空白?

2、寫出以下各步的化學反應式:

①蛋白質消化

②氨的蒸餾

?氨的滴定

3.指出本測定方法產生的誤差的原因。